冷冻电镜的重建：从二维投影到原子坐标

电子束穿过样品时会与原子发生散射，重原子散射强，轻原子散射弱，这个差异就是成像信号的来源。问题在于电子与物质作用太强，样品稍厚就穿不透，剂量稍大结构就被打坏。冷冻电镜的解法是让样品足够薄、温度足够低，再把成千上万个随机取向的颗粒投影收集起来，按角度归并后用算法反推三维电子密度。分辨率优于3埃时，氨基酸侧链的形状就能辨认。

样品制备决定成败。蛋白溶液滴在带孔的铜网上，滤纸吸走多余液体，再以极快速度投入液态乙烷，冷却速率可达每秒十万度以上，水来不及结晶，形成玻璃态冰。冰太厚，电子穿不透，图像一片灰；冰太薄，蛋白会变性或全部挤到气液界面上，取向变得单一。这一步至今带点手艺成分，同一个样品换个人做，结果可能差很多。

成像要在低剂量下完成，通常控制在每平方埃20到30个电子，否则辐照损伤会让侧链先崩解。低剂量意味着单张图像信噪比极低，颗粒几乎淹没在噪声里，只能靠后续平均把信号累加出来。直接电子探测器把电子直接转换为电信号，省去闪烁体转换的损失，配合能量过滤，是近年分辨率提升的关键硬件。

数据处理是反复迭代的过程。先挑出颗粒，做二维分类剔除坏图和杂蛋白，再生成初始三维模型，然后精修角度与位移，几轮之后才得到可解释的密度图。取向分布不均是常见麻烦，某些角度缺失会让重建出现拉长与模糊，解决办法是倾斜样品台多拍一组，或者用相位板增强低分辨率对比度。一个中等规模的数据集，计算往往要跑上数天。所以同一批数据换一套处理流程，可能得到不同的分辨率。

它擅长看静态结构，对构象变化的动态过程只能靠捕捉不同状态来间接推断。小于5万道尔顿的蛋白仍然吃力，柔性区域通常看不清。常见误解是以为冷冻电镜直接拍到了分子的照片，实际上是大量颗粒的平均结果，平均在提高信噪比的同时也抹掉了个体差异，所以看到的结构更像一个共同骨架，而不是某一个分子的真实姿态。